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研究生: 王秀觀
Hsiu-Kuan Wang
論文名稱: 反轉錄病毒起動子捕捉載體之製造
Construction of retroviral promoter trap vector
指導教授: 李桂楨
Lee, Guey-Jen
學位類別: 碩士
Master
系所名稱: 生命科學系
Department of Life Science
畢業學年度: 83
語文別: 中文
中文關鍵詞: 反轉錄病毒,起動子,起動子捕捉載體
英文關鍵詞: retrovirus, promoter, promoter trap vector
論文種類: 學術論文
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  • 本論文之主要目的,在發展出新的反轉錄病毒起動子捕捉載體,以
    期更有效率的用來捕捉細胞基因的起動子。U3.beta.-Geo/SupF 質體 3
    端不帶有促進子的 LTR 的 U3 區插入了在同一解讀架構上的.beta.-
    galactosidase (.beta.-Gal ) 基因和neomycin phosphotransferase
    ( Neo ) 基因的接合標識基因(簡稱.beta.-Geo 基因)。我們將 U3
    .beta.-Geo/SupF 質體 3 端 U3 區之起動子序列切除而得.DELTA.
    U3.beta.-Geo/SupF 質體。以 pBR322 質體之 OriAmp 基因置換掉
    .DELTA.U3.beta.-Geo/SupF 質體之SupF基因而得.DELTA.U3.beta.-
    Geo/OriAmp 質體。切除.DELTA.U3.beta.-Geo/OriAmp 質體 OriAmp
    基因上 286 bp 的有毒序列( PvuII-SapI )而得.DELTA.U3.beta.-
    Geo/OriAmp-286 質體。將各重組質體轉移入.PSI.2 包裝細胞中,
    得到重組病毒製造細胞株;由其產生之重組病毒再去感染NIH3T3 細胞,
    G418 篩選後,得到 G418R 細胞株數目,由此計算出各重組病毒
    之感染價數:U3.beta.-Geo/SupF 重組病毒價數為3.0~6.0 * 105 CFU /
    ml virus / 107 producer cells,與其他已知之 MoMuLV 重組病毒價數
    相近。.DELTA.U3.beta.-Geo/SupF 重組病毒價數為2.5~5.0 * 105 CFU/
    ml virus / 107 producer cells,比原來價數降低 15﹪左右。
    .DELTA.U3.beta.-Geo/OriAmp 及.DELTA.U3.beta.-Geo/OriAmp-286
    重組病毒價數皆為 1.5~3.0 * 105 CFU / ml virus /107 producer
    cells,比原來價數降低 50﹪。推論在 LTR 上插入 3.9 Kb .beta.-Geo
    基因並不會影響病毒的複製或插入;而 pBR322 質體之 OriAmp 基因
    置入病毒質體中造成病毒價數之降低,故 OriAmp 基因上之 135 核甘酸的
    有毒序列或 OriAmp 序列可能會影響病毒的複製或插入,或者此約 2 Kb
    片段的加長可能造成病毒包裝(packaging)的困難而導致病毒價數的降低。
    U3.beta.-Geo/SupF 重組病毒感染之細胞株生長良好、緻密,有較多大
    型細胞株形成。切除 U3 區之起動子後,去除起始於 5 端 LTR 而
    終止於 3 端 LTR 的轉錄,此種重組病毒感染之細胞株生長緩慢、
    不緻密,大型細胞株很少。大量培養出四個 G418R 細胞株:
    U3N5、U3N6、.DELTA.U3N1 及.DELTA.OAN1。南方吸漬法之結果顯示,
    U3N5、U3N6 細胞中皆有二處病毒插入位置,.DELTA.U3N1、.DELTA.OAN1
    細胞中皆只有一處病毒插入位置;除了.DELTA.OAN1 外,U3N5、U3N6
    及.DELTA.U3N1 細胞中之病毒結構並無重組發生。北方吸漬法之結果
    顯示,切除 U3 區之起動子後之.DELTA.U3N1 細胞去除了起始於 5 端
    LTR 而終止於 3 端 LTR 的轉錄。

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