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研究生：	蘇品源 Pin-Yen Shu
論文名稱：	氣相層析質譜法測定不同代謝性壓力狀態下老鼠血液中皮質固酮的濃度 Analysis of corticosterone in rat and mice plasma by Gas Chromatography-Selected Ion Monitoring Mass Spectrometry
指導教授：	林震煌
學位類別：	碩士 Master
系所名稱：	化學系 Department of Chemistry
論文出版年：	2002
畢業學年度：	90
語文別：	中文
中文關鍵詞：	氣相層析質譜法、代謝性、老鼠血液、皮質固酮
英文關鍵詞：	corticosterone, Gas Chromatography
論文種類：	學術論文
相關次數：	點閱：398 下載：37
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本研究以氣相層析質譜儀(GC-MS)，配合離子選擇偵測法(SIM)提供了一個簡單、高靈敏度的方法來偵測老鼠血液中皮質固酮的含量。老鼠的血液經過乙酸乙酯的萃取後，利用pentafluorobenzyloxime -trimethylsilyl (PFBO-TMS)為衍生試劑將皮質固酮衍生進行測量，並根據質譜譜峰選取m/z = 316, 648, 663, 678作為選擇性離子偵測法的主要譜峰來進行定性定量的工作。利用此法可將皮質固酮的偵測極限降至0.1 pg。實驗中並發現，當正常老鼠經接受類葡萄糖的藥物2-DG注射後，其血液中皮質固酮的濃度，隨著注射藥物量增加，而有明顯增加的趨勢。且在投予中藥柏子仁後，亦觀察到老鼠血液中皮質固酮濃度有增加的趨勢。

A simple, highly sensitive and specific method based on gas-
chromatography-selected ion monitoring (SIM) mass spectrometry has
been developed for the quantitation of corticosterone in rat and mice
plasma. After extraction of the plasma with ethyl acetate, the residue was trimethy-silylated with pentafluorobenzyl hydroxylamine-trimethyl- silyl (PFBO-TMS). Detection of the derivatives was accomplished by a quadruple mass spectrometer in the selected ion monitoring mode (m/z of 316, 648, 663 and 678). The detection limit of the assay was 0.1 pg on column. The results show that in the plasma of non-stressed animals only minor amounts of corticosterone were found; whereas in the plasma of stressed animals, it was dramatically increased. And we also found that when the animals were treated with Thujae orientails semen, the concentration of corticosterone in plasma was enhanced. The method developed here can be used to examine corticosterone levels as a marker of stress in rats and mice and may also be used for estimation of the effect of medications.

中文摘要．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．I
英文摘要．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．II
主目錄．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．III
表目錄．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．VII
圖目錄．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．VIII
第一章	、緒論．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1
1-1 研究目的．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1
1-2 分析物簡介．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．4
1-2-1荷爾蒙（Hormone）的定義．．．．．．．．．．．．．．．4
1-2-2荷爾蒙的種類．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．4
1-2-3人體主要的內分泌腺．．．．．．．．．．．．．．．．．．5
1-2-4回饋抑制．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．8
1-3 固醇類荷爾蒙．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．10
1-3-1固醇類荷爾蒙的生成及在生理上的意義．．．．．．．．．10
1-3-2壓力性荷爾蒙（Stress Hormone）．．．．．．．．．．．．13
1-3-3腎上腺．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．13
1-3-4皮質固酮的生成（corticosterone）．．．．．．．．．．．．19
1-3-5皮質固酮對生物體的影響．．．．．．．．．．．．．．．19
1-4藥物對荷爾蒙的影響．．．．．．．．．．．．．．．．．．19
1-4-1柏子仁（Thuja orientalis Semen）．．．．．．．．．．．19
1-4-2柏子仁與荷爾蒙作用．．．．．．．．．．．．．．．．．21
1-5皮質固酮濃度的測定方法．．．．．．．．．．．．．．．．22
1-5-1放射性免疫法（radioimmunoassay, RIA）．．．．．．．．．22
1-5-2螢光法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．24
1-5-3高效率液相層析儀-紫外光偵測法（HPLC-UV）．．．．．．25
1-5-4高效率液相層析儀-電灑式離化質譜法（HPLC-ESI-MS）．．26
1-5-5液相層析儀-電灑式離化質譜法（LC-ESI-MS）．．．．．．．26
1-6本研究採用氣相層析質譜法測定皮質固酮的原因．．．．．．28
第二章、實驗方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．32
2-1儀器．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．32
2-1-1氣相層析質譜法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．32
2-1-2氣相層析儀．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．33
2-1-3氣相層析儀與質譜儀間之界面．．．．．．．．．．．．．34
2-1-4離子化室（Ionization Chamber）．．．．．．．．．．．．．35
2-1-5質量分析器．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．36
2-1-6離子偵測器．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．37
2-1-7資料處理．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．38
2-1-8氣相層析質譜儀．．．．．．．．．．．．．．．．．．．38
2-1-9其他使用到的儀器．．．．．．．．．．．．．．．．．．39
2-2實驗步驟與方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．40
2-2-1標準溶液的製備．．．．．．．．．．．．．．．．．．．40
2-2-2器材的清洗．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．41
2-2-3 樣品的前處理．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．42
2-2-4質譜儀上機前調整．．．．．．．．．．．．．．．．．．43
2-2-5空白值之確立．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．45
2-2-6氣相層析質譜儀相關分析條件．．．．．．．．．．．．．45
2-2-7檢量線的建立．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．46
2-2-8偵測極限（Detection limit）．．．．．．．．．．．．．．．46
2-2-9回收率（Recovery）計算．．．．．．．．．．．．．．．47
2-2-10穩定性（Stability）．．．．．．．．．．．．．．．．．．47
2-2-11真實樣品的取得．．．．．．．．．．．．．．．．．．．48
2-3藥品．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．51
第三章、結果與討論．．．．．．．．．．．．．．．．．．53
3-1氣相層析質譜法分析皮質固酮標準品的衍生物．．．．．．．53
3-2皮質固酮濃度的定量與檢量線．．．．．．．．．．．．．．59
3-3皮質固酮標準品添加法與回收率．．．．．．．．．．．．．61
3-3-1標準品添加．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．61
3-3-2回收率（Recovery）．．．．．．．．．．．．．．．．．．64
3-4真實樣品（Real sample）．．．．．．．．．．．．．．．．67
3-4-1未受壓程度對小白鼠血液中皮質固酮的濃度的影響．．．．67
3-4-2不同受壓程度的老鼠血液中皮質固酮的定量分析．．．．．69
3-5柏子仁中藥的影響．．．．．．．．．．．．．．．．．．．74
3-6離化源的探討．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．79
第四章、結論．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．82
第五章、參考文獻．．．．．．．．．．．．．．．．．．．84
【附錄】
氣相層析質譜儀（GC5890、MSD5973）操作手冊．．．．．．．90
論文著作．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．94







表目錄
Table 1、
正常老鼠血液中添加不同濃度皮質固酮標準品經萃取衍生後所測得知回收率與精確度（RSD）值．．．．．．．．．．．．．．．．66

Table 2、
三種不同受壓程度老鼠用選擇性離子偵測法（SIM）經重複定量後所得之結果．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．71

Table 3、
老鼠血液置於-18℃冰箱兩週後，偵測皮質固酮含量之結果．．．73

Table 4、
老鼠施打不同濃度的柏子仁磷酸鹽溶液後，偵測皮質固酮含量之結果
．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．76

Table 5、
老化老鼠施打不同濃度的柏子仁磷酸鹽溶液後，偵測皮質固酮含量之結果．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．77




圖目錄
圖1-1、荷爾蒙作用於細胞的流程圖．．．．．．．．．．．．．4
圖1-2、人體主要的內分泌腺．．．．．．．．．．．．．．．．5
圖1-3、內分泌腺與其分泌的荷爾蒙種類．．．．．．．．．．．7
圖1-4、下視丘與腦垂腺作用示意圖．．．．．．．．．．．．．8
圖1-5、甲狀腺素的抑制回饋．．．．．．．．．．．．．．．．9
圖1-6、皮質固酮、孕酮、睪固酮的分子結構圖．．．．．．．．10
圖1-7、腎上腺固醇類荷爾蒙合成途徑．．．．．．．．．．．．12
圖1-8、腎上腺皮質促素（ACTH）的作用機制．．．．．．．．14
圖1-9、細胞免疫的過程．．．．．．．．．．．．．．．．．．17
圖1-10、放射性免疫法競爭性原理示意圖．．．．．．．．．．22
圖1-11以放射性免疫法測定固醇類激素所得之結合率
．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．23
圖1-12以螢光法測量血液中皮質固酮的含量．．．．．．．．．24
圖1-13、HPLC-UV以不同受壓程度老鼠血液中皮質固酮含量
．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．25

圖1-14、HPLC-ESI-MS偵測人體血清中皮質固酮（濃度0.52 nmol/ mL）之層析圖．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．26

圖1-15、液相層析儀-電灑式離化質譜法偵測皮質固酮之偵測極限（A）空白血清（B）添加0.3 ppb皮質固酮後萃取分析．．．．．．．27
圖1-16、正常與受壓老鼠血液中皮質固酮濃度的變化情形
．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．28
圖1-17、衍生試劑 Pentafluorobenzyloxyamine（PFBO）的合成
．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．29

圖1-18、以PFBO-TMS衍生法同時偵測其它固醇類激素（A）睪固酮（B）孕酮（C）可體松 之NICI質譜圖

．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．31

圖2-1、質譜儀常見之離化法．．．．．．．．．．．．．．．．32
圖2-2、氣相層析儀之氣化室．．．．．．．．．．．．．．．．33
圖2-3、氣相層析儀中常見的管柱形式．．．．．．．．．．．．34
圖2-4、電子衝擊游離法（EI）之離子化室．．．．．．．．．．36
圖2-5、四極式質量分析器構造圖及其電場情形．．．．．．．．36
圖2-6、質譜儀的內部組成．．．．．．．．．．．．．．．．．37
圖2-7、皮質固酮之衍生反應．．．．．．．．．．．．．．．．42
圖2-8、PFTBA（Perfluorotri-n-butylamine）調機．．．．．．．．44
圖3-1、皮質固酮標準品衍生物之氣相層析圖
．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．55
圖3-2、皮質固酮標準品衍生物在滯留時間18.4分鐘之質譜圖
．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．56
圖3-3、皮質固酮衍生物離子化之後其質譜斷裂譜峰的推斷
．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．
圖3-4、皮質固酮標準品衍生物以選擇性離子偵測法（SIM）所得到的氣相層析圖．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．58

圖3-5、對不同濃度皮質固酮的標準品，與選擇性離子偵測法（SIM）所得之譜峰面積，取其對數值，做出檢量線圖
．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．60

圖3-6、正常老鼠血液中spike 300 ppb皮質固酮標準品經萃取衍生的步驟後所得的氣相層析圖
．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．62

圖3-7、正常老鼠血液中spike 300 ppb皮質固酮標準品，以選擇性離子偵測法（SIM）選取316、648、 663、678 質譜譜峰所得之氣相層析圖
．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．63


圖3-8、三種不同濃度的皮質固酮標準品（10、100、1000 ng/ml）添加至正常老鼠（unstress mouse）的血液當中，經過萃取衍生後，所得的萃取回收率圖（n = 3）
．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．65

圖3-9（A）未受壓（unstress）小白鼠氣相層析圖（B）受壓（stress）小白鼠氣相層析圖
．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．68

圖3-10、三種不同受壓程度的老鼠血液經萃取衍生後之氣相層析圖（A）未受壓（B）急性（C）慢性受壓老鼠血液量測結果
．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．70


圖3-11三種不同受壓程度老鼠，血液中皮質固酮濃度變化示意圖
．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．72

圖3-12、施打不同濃度的柏子仁磷酸鹽溶液（A）0（B）0.1（C）0.5（D）1.0 mg/g所得到之氣相層析質譜圖
．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．75

圖3-13正常與老化老鼠施打柏子仁磷酸鹽溶液後，血液中皮質固酮濃度的變化關係圖
．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．78

圖3-14、不同濃度樣品在離化源有不同的離化程度示意圖
．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．79

圖3-15、在不同濃度（A）0.1ppb（B）10ppm情況下離化源電壓與氣相層析譜峰積分面積的關係圖
．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．81
                                

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