簡易檢索 / 詳目顯示

回結果列表
研究生： 柯嘉玲
論文名稱： 具α-2,3-Sialyltransferase功能性之磁性奈米粒子及其應用
α-2,3-Sialyltransferase Functionalized Magnetic Nanoparticle and its Application
指導教授： 陳焜銘
Chen, Kwun-Min
林俊成
Lin, Chun-Cheng
學位類別： 碩士
Master
系所名稱： 化學系
Department of Chemistry
論文出版年： 2006
畢業學年度： 95
語文別： 中文
中文關鍵詞： α-2,3-sialyltransferase 、magnetic nanoparticle 、intein
論文種類： 學術論文
相關次數： 點閱：178  下載：0 
分享至:
查詢本校圖書館目錄 查詢臺灣博碩士論文知識加值系統 勘誤回報

    • 本論文中為發展蛋白質的快速純化和酵素的重複使用，以pTYB1及pTXB1此intein系列之載體分別表達，eGFP-intein及α-2,3-sialyltransferase-intein這兩種融合蛋白，利用intein 之特性，分別在eGFP及α-2,3-sialyltransferase之C端進行修飾，以利其專一位相固化於磁性奈米粒子上。透過磁鐵與磁性奈米粒子之間的磁力吸引，可從表現完之混合蛋白質，快速的純化出eGFP及α-2,3-sialyltransferase。不需要繁瑣的更換緩衝溶液系統，和長時間的純化步驟，目標蛋白質可快速地固化於磁性奈米粒子上，並可透過磁鐵純化。我們亦證明固化後之酵素活性並無改變，且在酵素反應完之後，可快速將酵素與反應物分離，回收的酵素可再利用，更加符合經濟效應。

    目錄．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．I 圖表目錄．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．IV 簡寫表．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． VII 摘要．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．IX 第一章 序論．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 01 1-1磁性粒子於生物科技應用．．．．．．．．．．．．．．．．01 1-2醣類與細胞間之辨識．．．．．．．．．．．．．．．．．．02 1-3唾液酸 (sialic acid)．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 05 1-4唾液酸轉移酶 (α-2,3-sialytransferase ,α-2,3-SiaT)應用．．．．． 06 1-5蛋白質專一性 (site-specific)的固定．．．．．．．．．．．．08 1-6 intein於生物科技應用．．．．．．．．．．．．．．．．．．11 1-7唾液酸轉移酶 (α-2,3-sialytransferase )的固定．．．．．．．．13 第二章 結果與討論．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．15 2-1合成6-(Dansyl)-aminohexyl O-β-D-galactopyranosyl- (1,4)-β-D-glucopyranoside．．．．．．．．．．．．．．．．15 2-2建構含α-2,3 SiaT 酵素基因的重組載體 (recombinate DNA) ．16 2-2-1引子設計．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．17 2-2-2聚合酶鏈反應 (polymerase chain reaction,PCR)的條件．．．19 2-2-3 T-A cloning．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．23 2-2-4確定DNA序列使用之方法．．．．．．．．．．．．．．．28 2-2-5 α-2,3 SiaT-pTXB1建立重組載體．．．．．．．．．．．．29 2-3 α-2,3-sialytransferase (α-2,3-SiaT)的表現與純化．．．．．．．33 2-3-1 α-2,3-SiaT於pTXB1及pTYB1的表現差異．．．．．．．．37 2-3-2 IPTG 調控蛋白質的表現．．．．．．．．．．．．．．．．39 2-4 α-2,3 SiaT活性測試．．．．．．．．．．．．．．．．．．40 2-4-1 α-2,3 SiaT酵素反應的pH值最佳化．．．．．．．．．．．43 2-5目標蛋白固化 (the immobilization of target protein) ．．．．．44 2-5-1 eGFP重組載體建構．．．．．．．．．．．．．．．．．．44 2-5-2 eGFP的表現與純化．．．．．．．．．．．．．．．．．．47 2-5-3螢光蛋白的固化．．．．．．．．．．．．．．．．．．．51 2-5-4固化於磁性奈米粒子的eGFP定量．．．．．．．．．．． 52 2-5-5 α-2,3 SiaT的固化．．．．．．．．．．．．．．．．．．．53 2-5-6固化於磁性奈米粒子的α-2,3 SiaT定量．．．．．．．．．．56 2-5-7固化前與固化後的α-2,3 SiaT活性比較．．．．．．．．．．57 2-5-8固化於磁性奈米粒子的α-2,3 SiaT的重複使用性．．．．．．60 2-6結論．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．62 第三章 實驗材料與方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．63 3-1一般實驗方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．63 3-2實驗步驟及光譜資料．．．．．．．．．．．．．．．．．．64 3-3 pH值最佳化之酵素反應．．．．．．．．．．．．．．．．．66 3-4固化前與固化後的α-2,3 SiaT活性比較．．．．．．．．．．67 3-5固化後的α-2,3 SiaT重複使用．．．．．．．．．．．．．．68 3-6菌株、質體與培養基．．．．．．．．．．．．．．．．．．68 3-7 E.coli 質體DNA抽取．．．．．．．．．．．．．．．．．．69 3-8洋菜膠體上的DNA片段回收與純化．．．．．．．．．．．71 3-9 DNA黏接反應 (ligation) ．．．．．．．．．．．．．．．．72 3-10質體轉形作用．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．73 3-10-1勝任細胞 (competent cell)之製備．．．．．．．．．．．．73 3-10-2轉型作用 (Transformation) ．．．．．．．．．．．．．．73 3-11 DNA 膠體電泳．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．74 3-12融合酵素蛋白的表現及純化分析．．．．．．．．．．．．．76 3-13 SDS-PAGE膠體電泳．．．．．．．．．．．．．．．．．．79 3-14蛋白質的定量分析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．81 參考文獻．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．82 附錄．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．90

    1. (a) Huang, S. -H.；Liao, M. -H.；Chen D.-H.
    Biotechnol. Prog. 2003, 19, 1095-1100.
    (b) Liao, M. -H；Chen D.-H. J. Mol. Catal. B:Enzym. 2002, 18, 81-87.
    (c) Liao, M. -H；Chen D.-H. J. Mol. Catal. B: Enzym. 2002, 16, 283-291.
    (d) Liao, M. -H；Chen D.-H. Biotechnol.Lett. 2001, 23, 1723-1727.
    2. Halling, P. J.；Dunnill, P. Enzyme Microb. Technol. 1980, 2, 2-10.
    3. Arica, M. Y.；Yavuz, H.；Patir, S.；Denizli, A. J. Mol. Catal. B: Enzym. 2000, 11, 127-138.
    4. Tong, X. D.；Xue, B.；Sun, Y. Biotechnol. Prog. 2001, 17, 134-139.
    5. Cocker, T. M.；Fee, C. J.；Evans, R. A. Biotechnol. Bioeng.
    1997, 53, 79-87.
    6. Sauzedde, F.；Elaissari, A.；Pichot, C. Macromol. Symp. 2000, 151, 617-623.
    7. Rudge, S. R.；Kurtz, T. L.；Vessely, C. R.；Catterall, L. G.；Williamson, D. L. Biomaterials 2001, 21, 1411-1420.
    8. Varlan, A. R.；Suls, J.；Jacobs, P.；Sansen, W. Biosens. Bioelectron. 1995, 10 (8), xv-xix.
    9. Krogh, T. N.；Berg, T.；Højrup, P. Anal. Biochem. 1999, 274, 153-162.
    10. West, J. L.；Halas, N. J. Curr. Opin. Biotechnol. 2000, 11, 215-217.
    11. Dresco, P. A.；Zaitsev, V. S.；Gambino, R. J.；Chu, B. Langmuir
    1999, 15, 1945-1951.
    12. Koeller, K. M.；Wong, C.-H. Chem. Rev. 2000, 100, 4465-4493.
    13. (a) Varki, A. Glycobiology 1993, 3, 97-130.
    (b) Dwek, R. A. Chem Rev. 1996, 96, 683-720.
    14. Miller-Podraza, H.；Milh, M. A.；Bergstrom, J.；Karlsson, K.A. Glycoconj. J. 1996, 13, 453-460.
    15. (a) Flitsch, S. L. Curr. Opin. Chem. Biol. 2000, 4, 619-625.
    (b) Koeller, K. M.；Wong, C.-H. Nature 2001, 409, 233-240.
    (c) Sears, P.；Wong, C.-H. Science 2001, 291, 2344-2350.
    16. (a) Field, M. C.；Wainwright, L. J. Glycobiology 1995, 5, 463-472.
    (b) Tsuji, S. J. Biochem. 1996, 120, 1-13.
    17. (a) Baisch, G.；Ohrlein, R.；Streiff, M. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1998, 8, 157-160.
    (b) Sujino, K.；Uchoyama, T.；Hindsgaul, O.；Seto, N. O. L.；Wakarchuk, W. W.；Palcic, M. M. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 1261-1269.
    (c) Qian, X.；Sujino, K.；Otter, A.；Palcic, M. M.；Hindsgaul, O.
    J.Am. Chem. Soc. 1999, 121, 12063-12072.
    (d) Nishida, Y.；Tamakoshi, H.；Kobayashi, K. J.；Thiem, J.
    Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39, 2000-2003.
    18.(a) Thorson, J. S.；Hosted, T. J.；Jiang, J.；Biggins, J. B.；Ahlert, J.； Ruppen, M. Curr. Org. Chem. 2001, 5, 89-111.
    (b) Jiang, J.；Biggins, J. B.；Thorson, J. S. J. Am Chem. Soc. 2000, 122, 6803-6804.
    (c) Jiang, J.；Biggins, J. B.；Thorson, J. S. Angew. Chem., Int. Ed. 2001, 40, 1502-1505.
    (d) Solenberg, P. J.；Matsushima, P.；Stack, D. R.；Wilkie, S. C.；C. Thompson, R.；Baltz, R. H. Chem. Biol. 1997, 4, 195-201.
    19. Izumi, M.；Shen, G.-J.；Wacowich-Sgarbi, S.；Nakatani, T.；Plettenburg, O.；Wong, C.-H. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 10909-10918.
    20. Sears, P.；Wong, C.-H. Cell, Mol. Life Sci. 1998, 54, 223-252.
    21. Boons, G.-J.；Demchenko, A.-V. Chem. Rev. 2000, 100, 4539-4566.
    22. Okamoto, K.；Goto, T. Tetrahedron 1990, 46, 5835-5857.
    23. DeNinno, M. P. Synthesis 1991, 583-593.
    24. Kanie, O.；Hindsgaul, O. Curr. Opin. Struct. Biol. 1992, 2, 674-681.
    25. (a) Ercegovic,T.；Magnusson, G. J. Org. Chem. 1995, 60, 3378-3384.
    (b) Ercegovic, T.；Magnusson, G. J. Org. Chem. 1996, 61, 179-184.
    (c) Hossain, N.；Magnusson, G. Tetrahedron Lett. 1999, 40, 2217-2220.
    (d) Ito, Y.；Nunomura, S.；Shibayama, S.；Ogawa, T. J. Org. Chem. 1992, 57, 1821-1831.
    26. Castro-Palomino, J. C.；Tsvetkov, Y. E.；Schneider, R.；Schmidt, R. R. Tetrahedron Lett. 1997, 38, 6837-6840.
    27. Wang, Z.；Zhang, X.-F.；Ito, Y.；Nakahara, Y.；Ogawa, T.
    Bioorg. Med. Chem. 1996, 4, 1901-1908.
    28. Eppinger, J.；Funeriu, D. P.；Miyake, M.；Denizot, L.；
    Miyake, J. Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 3806-3810.
    29. Schmitz O. J.；Wörth C. C. T.；Stach D.；Wießler M.
    Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 4389.
    30. Bock, C.；Coleman, M.；Collins, B.；Davis, J.；Foulds, G.；Gold, L.； Greef, C.；Heil, J.；Heilig, J. S.；Hicke, B.；Hurst, M. N.；Husar, G. M.；Miller, D.；Ostroff, R.；Petach, H.；Schneider, D.；Vant-Hull, B.；Waugh, S.；Weiss, A.；Wilcox, S. K.；Zichi, D. Proteomics 2004, 4, 609-618.
    31. Zhu, H.；Bilgin, M.；Bangham, R.；Hall, D.；Casamayor, A.；Bertone, P.；Lan, N.；Jansen, R.；Bidlingmaier, S.；Houfek, T.；Mitchell, T.； Miller, P.；Dean, R. A.；Gerstain, M.；Snyder, M. Science 2001, 293, 2101-2105.
    32. Soellner, M. B.；Dickson, K. A.；Nilsson, B. L.；Raines, R. T.
    J.Am. Chem. Soc. 2003, 125, 11790-11791.
    33. Kohn, M.；Wacker, R.；Peters, C.；Schroder, H.；Soulere, L.；Breinbauer, R.；Niemeyer, C. M.；Waldmann, H. Angew. Chem. Int. Ed. 2003, 42, 5830-5834.
    34. Camarero, J. A.；Kwon, Y.；Coleman, M. A. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 14730-14731.
    35. Ivannikova, T.；Bintein, F.；Malleron, A.；Juliant, S.；Cerutti, M.；Harduin-Lepers, A.；Delannoy, P.；Augé, C.；Lubineau, A.
    Carbohydr. Res. 2003, 338, 1153-1161.
    36. (a) Xu, C.；Xu, K.；Gu, H.；Zheng, R.；Liu, H.；Zhang, X.；Guo, Z.；Xu, B. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 9938-9939.
    (b) Xu, C.；Xu, K.；Gu, H.；Zhong, X.；Guo, Z.；Zheng, R.；Zhang, X.；Xu, B. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 3392-3393.
    (c) Abad, J. M.；Mertens, S. F. L.；Pita, M.；Fernandez, V. M.；Schiffrin, D.J. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 5689-5694.
    37. Johnson, D. L.；Martin, L. L. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 2018-2019.
    38. Araújo, A. D.；Palomo, J. M.；Cramer, J.；Köhn, M.；Schröder, H.；Wacker, R.；Niemeyer, C.；Alexandrov, K.；Waldmann, H.
    Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 296-301.
    39. Watzke, A.；Köhn, M.；Gutierrez-Rodriguez, M.；Wacker, R.；Schröder, H.；Breinbauer, R.；Kuhlmann, J.；Alexandrov, K.；Niemeyer, C. M.； Goody, R. S.；Waldmann, H. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 1408-1412.
    40. Youngeun, K.；Matthew, A. C.；Julio, A. C. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 1726-1729.
    41. Lin, P.-C.；Ueng, S.-H.；Tseng, M.-C.；Ko, J.-L.；Huang, K.-T.；Yu, S.-C.；Adak, A. K.；Chen, Y.-J.；Lin, C.-C. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 4286-4290.
    42. Hirata, R.；Ohsumk, Y.；Nakano, A.；Kawasaki, H.；Suzuki, K.；Anraku, Y. J. Biol. Chem. 1990, 265, 6726-6733.
    43. Perler, F.B. Nucleic Acids Res. 1999, 27, 346-347.
    44. Perler, F. B.；Davis, E. O.；Dean, G. E.；Gimble, F. S.；Jack, W. E.；Neff, N.；Noren, C. J.；Thorner, J.；Belfort, M. Nucleic Acids Res. 1994, 22, 1125-1127.
    45. Noren, C. J.；Wang, J.；Perler, F. B. Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39, 450-466.
    46. Shi, J.；Muir, T. W. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 6198-6206.
    47. Xu, M. Q.；Perler, F. B. EMBO J. 1996, 15, 5146-5153.
    48. Chong, S. R.；Shao, Y.；Paulus, H.；Benner, J.；Perler, J. B.；Xu, M. Q. J.Biol.Chem. 1996, 271, 22159-22168.
    49. Hofmann, R. M.；Muir, T. W. Curr. Opin. Biotechnol. 2002, 13, 297-303.
    50. Even, T. C.；Benner, J. M.；Xu, Q. Prot. Sci. 1998, 7, 2256-2264.
    51. Kochendoerfer, G. G. Science, 2003, 299, 884-887.
    52. Cotton, G. J.；Muir, T. W. Chem. Biol. 2000, 7, 253-261.
    53. Stempfer, G.；Holl-Neugebauer, B.；Rudolph, R.
    Nature Biotechnology 1996, 14, 329-334.
    54. Lue, R. Y. P.；Chen, G. Y. J.；Hu, Y.；Zhu, Q.；Yao, S. Q.
    J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 1055-1062.
    55. David, P.C.；Lonnie, D. R. 分子生物學, 藝軒圖書出版社
    56. Mullis, K .B.；Faloona, F. A. Methods Enzymol. 1987, 155, 335-350.
    57. Saiki, R. K.；Gelfand, D.H.；Stoffel, S.；Scharf, S. J.；Higuchi, R.； Horn, G. T.；Mullis, K. B.；Erlich, H. A. Science 1988, 239, 487-491.
    58. Horwitz, J. P.；Chua, J.；Curby, R. J., ；Tomson, A. J.；DaRooge, M. A.；Fisher, B. E.；Mauricio, J.；Klundt, I. J. Med. Chem. 1964, 7, 574-575.
    59. Sanger, F.；Nicklen, S.；Coulson, A. R. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1977, 74, 5463-5467.
    60. Bradford, M. Anal. Biochem. 1976, 72, 248-254.
    61. Gilbert, M.；Watson, D. C.；Cunningham, A.-M.；Jennings,
    M. P.；Young, N. M.；Wakarchuk, W. W. J. Biol. Chem. 1996, 271, 28271-28276.
    62. Auge´, C.；Malleron, A.；Tahrat, H.；Marc, A.；Goergen, J.-L.
    ；Cerutti, M.；Steelant, W. F. A.；Delannoy, P.；Lubineau, A.
    Chem. Commun. 2000, 20, 2017–2018.
    63. Dyal, A.；Loos, K.；Noto, M.；Chang, S.W.；Spagnoli, C.；Shafi, K.V.P.M.；Ulman, A.；Cowman, M.；Gross, R. A.
    J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 1684-1685.

    無法下載圖示
    QR CODE