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Author: 曾筱茜
Thesis Title: 金奈米粒子應用於類志賀氏毒素抑制劑之設計與研究
Advisor: 陳家俊
Degree: 碩士
Master
Department: 化學系
Department of Chemistry
Thesis Publication Year: 2005
Academic Year: 93
Language: 中文
Keywords (in Chinese): 金奈米粒子 、類志賀氏毒素
Thesis Type: Academic thesis/ dissertation
Reference times: Clicks: 571  Downloads: 27 
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    • 感染類志賀氏毒素會導致腸道出血性大腸炎，還會引起危險的溶血尿毒症候群，嚴重者更可能會造成腎臟的永久敗壞和中樞神經的傷害。而其感染途徑是藉由先結合到細胞膜表面，再行釋放毒素，所以若能抑制其結合到細胞膜表面，則可以抑制此毒素。類志賀氏毒素為AB5結構，A單位是毒性部分而B單位則是與細胞結合的部分。B單位是一個五聚體，每一個單體上有三個結合點，與細胞膜上的Pk抗原有特異性的結合力，這種多價牙基與多價受器的結合，稱為多價作用力（Multivalent interaction）。本論文包括I型類志賀式毒素B單位的純化以及利用金奈米粒子作為多價載體設計抑制劑，包含有不同大小的金奈米粒子，和不同鏈長的Pk抗原類似物包覆其上，利用表面電漿共振光譜儀測量I型類志賀式毒素B單位與Pk抗原類似物的動力學解離常數，研究金奈米粒子大小及Pk類似物鏈長改變後抑制效果的比較。

    目錄 中文摘要 ……………………………………………………………VI 英文摘要 ……………………………………………………………VII Chapter 1 緒論……………………………………………………1 1-1 奈米材料…………………………………………………………1 1-1-1 金奈米粒子之應用……………………………………………3 1-2 多價效應（Multivalent effect）………………………………3 1-3 親醣蛋白與醣類分子作用力之量測………………………………7 1-3-1 血球凝集抑制試驗……………………………………………7 1-3-2 酵素連結親醣蛋白分析法………………………………………8 1-3-3 等溫滴定卡計 ………………………………………………9 1-3-4 表面電漿共振偵測…………………………………………10 1-4 類志賀氏毒素（Shiga-like toxin, SLT）相關研究…………12 Chapter 2 實驗……………………………………………………17 2-1 研究動機與目的 ………………………………………………17 2-2 類志賀氏毒素B單位（VTIB）之表現與純化………………18 2-2-1藥品 ……………………………………………………………18 2-2-2 儀器……………………………………………………………19 2-2-3 實驗步驟………………………………………………………19 2-3 醣包覆金奈米粒子抑制劑的設計……………………………23 2-4 表面電漿共振儀（BIACore）的量測 ………………………24 2-4-1 藥品……………………………………………………………24 2-4-2 儀器……………………………………………………………24 2-4-3 實驗步驟………………………………………………………26 Chapter 3 結果與討論………………………………………………28 3-1 類志賀氏毒素B單位的表現與分離……………………………28 3-1-1 蛋白質（VTIB）的純化 ……………………………………28 3-1-2 蛋白質濃度定量………………………………………………30 3-2 定量金奈米粒子上醣包覆的比例……………………………31 3-3 測量Pk抗原類似物與類志賀氏毒素B單位之親合力……33 3-3-1 選取實驗參數 ………………………………………………33 3-3-3 平衡常數之計算………………………………………………35 3-3-4 比較抑制劑之抑制能力 ……………………………………37 Chapter 4 結論……………………………………………………52 未來展望 ……………………………………………………………53 參考資料 ……………………………………………………………54 圖表目錄 圖 1- 1 微米至奈米尺度圖……………………………………………2 圖 1- 2 醣類結合物的生物合成及細胞辨識作用 ………………4 圖 1- 3 配位基結合的幾種反應機制9………………………………5 圖 1- 4 各種作為多價牙基之載體：(a) 一般小分子 (b)聚脂體 (c) 線狀高分子 (d)抗體 (e)蛋白質 (f)枝狀分子 (g)奈米粒子 …………6 圖 1- 5 HIA assays ……………………………………………………8 圖 1- 6 酵素連結免疫吸附分析法反應示意圖……………………8 圖 1- 7 等溫滴定卡計裝置圖 ………………………………………9 圖 1- 8 表面電漿共振示意圖 ……………………………………11 圖 1- 9類志賀氏毒素的結構 ……………………………………13 圖 1- 10由X-ray結晶繞射觀察VTIB和Pk三醣結合情形……14 圖 1- 11 1. Pk trisaccharide 2. dimeric bridged Pk trisaccharid 3. decamericSTARFISH…………………………………………15 圖 1- 12 VTIB與海星配位體的結合結構24 ………………………15 圖 1- 13用ELISA測量抑制效果……………………………………16 圖 2- 1 DEAE column裝置圖 ……………………………………21 圖 2- 2 Pk抗原類似物之結構 ……………………………………23 圖 2- 3醣包覆金奈米粒子作抑制劑 …………………………………23 圖 2- 4 BIACore儀器原理設計圖 ………………………………24 圖 2- 5 BIACore之感應圖29 ……………………………………25 圖 3- 1 由Tricine gel 確定VTIB的位置 ………………………30 圖 3- 2定量蛋白質濃度之標準檢量線 ……………………………31 圖 3- 3金感應片表面固定低密度配位基與醣蛋白結合效果更好 …34 圖 3- 4 VTIB蛋白濃度由上至下0.55~0.0068 M與Pk三醣之親合力 ……………………………………………………………………36 圖 3- 5 VTIB的結合常數計算 ……………………………………37 圖 3- 6 Pk dimer的抑制曲線…………………………………………39 圖 3- 7 Pk dimer的抑制平衡常數計算 ……………………………39 圖 3- 8 4-Pk-AuNP的抑制曲線 ……………………………………40 圖 3- 9 4-Pk-AuNP的抑制平衡常數計算 ………………………40 圖 3- 10 13-Pk-AuNP的抑制曲線 …………………………………41 圖 3- 11 13-Pk-AuNP的抑制平衡常數計算 ………………………41 圖 3- 12 20-Pk-AuNP的抑制曲線 …………………………………42 圖 3- 13 20-Pk-AuNP的抑制平衡常數計算 ………………………42 圖 3- 14 Pk spacer dimer的抑制曲線……………………………43 圖 3- 15 Pk spacer dimer的抑制平衡常數計算 ……………………43 圖 3- 16 13-Pk spacer-AuNP的抑制曲線 ……………………………44 圖 3- 17 13-Pk spacer-AuNP的抑制平衡常數計算 ………………44 圖 3- 18 抑制的模擬圖 ………………………………………………45 圖 3- 19 VTIB相對於4nm、13nm、20nm AuNP的大小比較…47 圖 3- 20 不同碳鍊長度造成的空間影響 ……………………………48 表 1 Pk三醣包覆金奈米粒子的比例……………………………32 表 2 Pk spacer三醣包覆金奈米粒子的比例 ………………………32 表 3 各個抑制劑的Ki和RIP值比較……………………………49 表 4 各個抑制劑的IC50…………………………………………50

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